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在我們探索EV功能的時候，最基礎的3個參數(shù)就是EV樣品的濃度，粒徑和分型。

濃度：EV的濃度信息對于發(fā)現(xiàn)新的生物標志物（即疾病相關的分子標志）以及診斷疾病都非常關鍵。同時，通過精準地測量EV的濃度，研究人員能夠更好地追蹤病人的疾病進展，并評估治療是否有效。

粒徑：通過EV粒徑檢測，可有效區(qū)分不同EV亞型，更深入地了解其起源或功能。EV粒徑檢測對于EV樣品制備的標準化和質量控制同樣至關重要。

分型：研究人員還需對EV進行表征并識別其蛋白表達。對EV進行表征分析，有助于研究人員了解EV的生物學功能，破譯EV在細胞間攜帶的特定信息/信號，發(fā)現(xiàn)內含物中的疾病特異性分子（DNA、RNA、microRNA等）。

“ 采用流式細胞術可以同步獲取這些重要參數(shù)，特別是可以通過測定EV中或膜表面的蛋白表達，檢測顆粒的物理和化學特性。隨著對EV研究的不斷深入，研究者們的關注點已經從整體EV群體逐步轉向更為細致的EV亞群分析，這種轉變有助于更精確地揭示EV在生理和病理過程中的具體功能?！?/p>

我們以從健康供體中分離的PPP（去血小板血漿）EV分群為例。3mL全血在200xg下離心5分鐘。從頂部取出1mL血漿，并通過200nm注射器過濾。使用70nm尺寸排阻柱（SEC）純化PPP。篩選出的組分用于單色染色和多色染色進行免疫分型。然后用以下抗體對選定的PPP組分進行染色：CD81 PB、CD9 FITC、CD63 APC、CD61 PC7和CD235a PE。在CytoFLEX納米流式細胞儀上采集樣本，并在CytExpert nano中進行分析。

檢測EV樣本時，樣品清潔度至關重要，因此在檢測前需要確保儀器的背景噪聲足夠低。CytoFLEX nano自帶Baseline檢測功能，可以自動檢查鞘液并基于滿足QC要求的預設閾值，自動監(jiān)測并分析背景信號，快速評估儀器清潔度。在運行實驗的同時，Baseline檢測功能也可以即時檢查儀器和緩沖液清潔度，保證樣品間攜帶污染率小于1%。

在上樣前，選擇合適的樣品濃度至關重要，以避免出現(xiàn)swarm現(xiàn)象。我們通過EPS（<6000 eps）、100%事件處理和避免粘連體，MdFI等維度，選擇適合的樣品稀釋比例。

在獲取檢測數(shù)據(jù)后，我們按照以下設門策略進行數(shù)據(jù)分析：

1.Gate on Singlets

2.Gate out CD235+ (possible aggregates) 

3. From CD235-, identify CD61+ (Platelet-originated EVs) and CD61- 

4. Further identify CD9+ and CD9- The last plots help to identify CD81+ and CD63+ from these subpopulation

CytoFLEX nano 納米流式分析儀使研究人員能夠清晰檢測血漿來源的EV。該分析儀可準確檢測和區(qū)分單個PPP EV顆粒（包括PB、FITC、PE、APC和PC7） 上的多個熒光通道中的信號，便于用戶監(jiān)測低表達的稀有陽性亞群（如CD63和標記紅細胞污染的CD235a）。

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11月1日，我們將與多位行業(yè)專家齊聚深圳，共同探討EV在多個領域的最新前沿應用，并分享從科學研究到商業(yè)化產品的完整開發(fā)路徑。